| 靈芝對抗體形成細胞和變態(tài)反應(yīng)的影響 |
| 【 整理發(fā)布：王力野生靈芝網(wǎng) 】 【 發(fā)布日期：7/6/2011 】 瀏覽次數(shù):2158 |
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提要 本文觀察靈芝對抗體形成細胞，大鼠被動皮膚過敏反應(yīng)，綿羊紅細胞引致遲發(fā)型過敏反應(yīng)，2，4-二硝基氯苯引起的接觸性皮炎及Arthus反應(yīng)的影響。研究發(fā)現(xiàn)靈芝無論在試管內(nèi)或整體均抑制抗體形成細胞的數(shù)目，明顯抑制遲發(fā)型過敏反應(yīng)及接觸性皮炎和Arthus反應(yīng)。但對大鼠的被動皮膚過敏反應(yīng)，僅有抑制趨勢。
關(guān)鍵詞 靈芝；遲發(fā)型過敏反應(yīng)；被動皮膚過敏反應(yīng)；接觸性皮炎；Arthus反應(yīng)
靈芝在民間作為藥用已有相當(dāng)悠久的歷史。在“本草綱目”中，靈芝列為上品，屬珍貴藥物。一般認為其具有保健作用，但對免疫功能的作用研究尚不多，作用機理亦不甚了解。本文主要觀察在日本增植的靈芝對抗體形成細胞及變態(tài)反應(yīng)的影響。
材 料 與 方 法
動物
昆明種小鼠，20～25g; Wistar大鼠，♂，150～200g，家免，2kg，均由上海醫(yī)科大學(xué)實驗動物部供應(yīng)。
試劑
靈芝熱水浸出物由日本和漢生藥研究所提供。作整體研究所用靈芝，以0.2%羧甲基纖維素鈉配制。試管內(nèi)研究所用靈芝溶于生理鹽水中，制備方法同前（本論文集第1頁）。置80℃水浴振蕩2h然后離心，上清液置于-4℃，直至使用，此為水溶部分。凍融部分制備也如前。
美洲商陸（PWM）、脂多糖（Lps）均為Sigma產(chǎn)品。RPMI-1640為GIBCO產(chǎn)品，含15mH Hepes，100U/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素及10%小牛血清。
試管內(nèi)研究溶血空斑形成細胞 （PFC）
小鼠頸椎脫位致死，取脾，脾細胞以RPMI-1640洗2次后，計數(shù)，于24孔培養(yǎng)板中每孔加入1ml含5×106個脾細胞，加入綿羊血紅細胞（SRBC），有的孔加入被測樣品，每組復(fù)孔3個，于37℃ 5% CO2中培養(yǎng)96h。培養(yǎng)結(jié)束時，收集細胞，洗2次，調(diào)至所需細胞濃度。以100μl脾細胞，100μl補體，50μl SRBC與0.25ml 0.4%瓊脂糖混合，由此取出100μl制片。全部玻片在37℃中培養(yǎng)3h，于倒置顯微鏡下檢測溶血空斑數(shù)。以t測驗進行統(tǒng)計分析。
整體研究溶血空斑形成細胞（PFC）
小鼠于d0腹腔注射2% SRBC 0.5ml鼠致敏。隨機分為3組，對照組與靈芝1、2組。對照組口服CMC，靈芝組分別口服125及500mg/kg qd.×4(d0～d３)，于ｄ4處死小鼠,測定各組小鼠脾臟之PFC數(shù)。
大鼠被動皮膚過敏反應(yīng)（PCA）
40只大鼠，隨機分成4組。對照組口服（組1）0.2% CMC，靈芝組（組2，組3）分別口服靈芝125及500mg/kg qd.×5(-d2～d2)，組4靜脈給色甘酸鈉。于d0全部大鼠皮內(nèi)注射IgE樣抗體（即抗天花粉蛋白抗血清，以括樓部分離所得天花粉蛋白為抗原）。當(dāng)大鼠背部以不同稀釋度IgE樣抗血清被動致敏后48h，也即各組大鼠末次服藥后2h，色甘酸鈉組靜脈注射10mg/kg后，立即靜脈注射內(nèi)含抗原10mg/kg的1%伊文氏藍溶液進行攻擊，30min后處死大鼠，測定背部皮膚藍染的程度。除測量藍染皮膚的直徑外，再剪下藍染部位，剪碎，置于定量NS∶丙酮=3∶7的溶液中，放置48h，離心，于620nm測光密度進行比較。
遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)（DTH）
每只小鼠于d0以10% SRBC 0.5ml/鼠腹腔注射致敏、靈芝組口服靈芝qd.×8(d0～d7)，于ｄ7在小鼠左足掌注射50μl 10% SRBC，左足掌注射等量NS，24h后測量左右足掌之體積差，以下式計算結(jié)果。
Δ=V=VL-VR
DNCB 引起的接觸性皮炎
以2，4-二硝氯苯（DNCB）作為刺激劑。小鼠剃去背部與腹部的毛，在d1及d2以20μl 50%的DNCB均勻涂在小鼠背部無毛區(qū)。對照組口服0.2% CMC qd.×16，靈芝組分別口服250及500mg/kg，qd.×16,地塞米松組腹腔注射10 mg/kg，qd.×3及q2d.×7。在d14以4% DNCB丙酮溶液20μl涂于腹部無毛區(qū)1×1cm的部位進行攻擊。32h以后，又以30μl 10% DNCB甘油溶液涂于左耳。30min后，靜注0.5% Evan’s藍溶液(0.1ml/10g)。再經(jīng)30min，小鼠頸椎脫位處死，以打洞器取下雙側(cè)耳朵，測重量差。并比較腹部皮膚藍染程度。
Arthus反應(yīng)
家兔Arthus反應(yīng)是Ⅲ型變態(tài)反應(yīng)的代表性病理模型，由IgG與IgM介導(dǎo)。每ml完全福氏佐劑中含卵蛋白10mg。每只家兔肌肉注射1mL，每周一次，共4次。最后一次注射卵蛋白后第9天背部剪毛。第10天在抗原攻擊前給藥。對照組靜注NS，靈芝組分別靜注0.5及1.0g/kg，地塞米松組靜注5mg/kg，1h后進行抗原攻擊，即在背部皮內(nèi)注射1%卵蛋白0.2ml/點,共4點。觀察抗原攻擊后不同時間局部紅腫的直徑與程度，分級記錄。
（++++）明顯出血，呈融合狀，并有壞死灶。
（+++）明顯充血，出血呈融合狀。
（++）中度充血，出血呈斑塊狀。
（+）輕度充血出血。
（-）無反應(yīng)。
結(jié) 果
一、 靈芝在試管內(nèi)對PFC的影響
實驗結(jié)果證明靈芝的水溶部分（Part A）及凍融部分（Part B）10～1000μg/ml都明顯抑制試管內(nèi)ＰＦＣ的形成（表２－１）。該作用與靈芝的濃度呈正相關(guān)。
表２－１ 靈芝在試管內(nèi)對ＰＦＣ的影響
劑量 ＰＦＣ／１０8細胞 抑制率
組別 μｇ／ｍｌ X±SD %
對照 -- 1890±164
A靈芝 10 1484±247 21.5*
靈芝 100 1203±312 36.4**
靈芝 1000 281±62 85.1**
B靈芝 10 938±265 50.4**
靈芝 100 1234±416 34.7*
靈芝 1000 266±94 86.0**
A:水溶部分LZ B:凍融部分LZ 對照:NS
X±SD:*P<0.05, **P<0.01
二、 靈芝對整體PFC的影響
靈芝口服125，500mg/kg，qd.×5明顯抑制小鼠脾臟內(nèi)PFC數(shù)(表2-2)。
表2-2 靈芝對整體PFC的影響
劑量 ＰＦＣ／１０8細胞 抑制率
組別 mg/kg X±SD %
對照組 -- 70400±7200
靈芝 125 41000±3250 41.8**
靈芝 500 26400±1720 62.5**
注:若d0腹腔注射羊紅細胞，則灌胃給藥期為d0～d4
對照組：0.2% CMC
X±SD; **P<0.01
三、 靈芝對大鼠PCA試驗的影響
研究結(jié)果表明色甘酸鈉靜注10mg/kg明顯抑制大鼠PCA反應(yīng)。靈芝口服125，500mg/kg qd.×5，對PCA反應(yīng)只有輕度抑制趨勢，無顯著統(tǒng)計學(xué)差異
四、 靈芝對遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)的影響
結(jié)果證明口服靈芝500mg/kg明顯抑制由SRBC引起的DTH反應(yīng)，環(huán)磷酰胺10mg/kg腹腔注射qd.×8亦有明顯抑制作用.
五、 靈芝對DNCB引起接觸性皮炎的作用
結(jié)果證明靈芝對于DNCB引起的接觸性皮炎有明顯抑制作用,口服250或500mg/kg qd.×16均有效。地塞米松10mg/kg亦有效（表2-3）。
表2-3 靈芝對接觸性皮炎的影響
劑量 動物數(shù) 耳增重% 皮膚
藥 物 mg/kg 藍染程度
對照組 -- 10 12.6%±9.7% 卅
地塞米松 10 10 2.5%±4.1%** ±
靈芝 250 9 3.7%±4.1%* 卄
靈芝 500 9 2.3%±3.1%** 卄
對照組:0.2% CMC, p.o. qd.×16
地塞米松:腹腔注射qd.×3→q0d.×7
靈芝:口服,qd.×16
耳增重%=△W/WR×100%·△W=W左-W右
*P<0.05, **P<0.01
六、靈芝對Arthus反應(yīng)的影響
結(jié)果見表2-4，2-5。對照組在抗原攻擊后2h開始已有充血出血，4～８ｈ融合成片狀出血，12h有壞死灶。地塞米松組在抗原攻擊后2h尚無反應(yīng)，4h開始有輕微反應(yīng)，6h以后有中度充血出血。靈芝0.5及1.0g/kg組，在抗原攻擊后2～8h的反應(yīng)明顯比對照組為輕，但8h以后與對照組比較已無明顯差別。
表2-4 靈芝對Arthus反應(yīng)的影響
劑量 抗原攻擊距 抗原攻擊后的炎癥反應(yīng)（cm）
藥物 給藥時間
（mg/kg） （min） 2h 4h 6h 8h 12h 24h
對照 -- 60 +++ +++ +++ +++ ++++ ++++
地塞米松 5 60 -- ± ++ +++ +++ +++
靈芝 500 60 ± + ++ +++ ++++ ++++
靈芝 1000 60 + ++ ++ +++ +++ ++++
表2-5 靈芝對Arthus反應(yīng)的影響
劑量 抗原攻擊距 抗原攻擊后的炎癥反應(yīng)（cm）
藥物 給藥時間
（mg/kg） （min） 2h 4h 6h 8h 12h
對照 -- 60 1.52±0.94 2.54±0.66 2.73±0.65 3.40±0.87 3.43±0.52
地塞米松 5 60 0 0.55±0.50 2.29±0.23 2.71±0.55 3.01±0.53
靈芝 500 60 0.45±0.48 1.74±0.66 2.38±0.35 2.72±0.15 2.82±0.10
靈芝 1000 60 0.27±0.07 1.54±1.05 1.84±0.21 2.82±0.49 2.89±0.46
討 論
日本靈芝的熱水提取物毒性很小。本實驗室在以往工作基礎(chǔ)上（1，2），以及參照有關(guān)實驗（3）研究證明小鼠口服該提取物5g/kg，觀察一周，無鼠死亡。本草綱目曾記載靈芝無毒，可以長期服用。
本文研究表明靈芝在試管內(nèi)（10～1000μg/ml）及在整體500mg/kg均可抑制抗體形成細胞的數(shù)目。通過淋巴細胞增殖的研究證明靈芝有免疫調(diào)節(jié)作用，當(dāng)機體在免疫功能低下時靈芝有上調(diào)作用。本文進一步證明，當(dāng)機體在過敏狀態(tài)時，免疫功能過強時，靈芝有下調(diào)的作用。本研究證明口服靈芝500mg/kg能抑制遲發(fā)型過敏反應(yīng)。由此證明靈芝對于Ⅰ，Ⅱ及Ⅳ型變態(tài)反應(yīng)均有抑制作用，進一步證明靈芝具有免疫調(diào)節(jié)作用。 |
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