| 靈芝對淋巴細胞增殖的影響 |
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本文研究在日本培植的靈芝（Ling Zhi, LZ, Ganoderma Lucidum, Fr. Karst）的熱水提取物對淋巴細胞增殖的影響。測定靈芝單獨及聯(lián)合Con A或Lps對小鼠脾細胞攝取3H-TdR的作用。靈芝口服300mg/kg qd.×10或在試管內(nèi)10~500μg/ml對淋巴細胞增殖有直接刺激作用，更高濃度（1000μg/ml）則產(chǎn)生抑制效應(yīng)。凍融部分較水溶部分的作用為強。靈芝對Con.A誘導(dǎo)的淋巴細胞增殖具有雙向調(diào)節(jié)作用，這主要與靈芝和Con A的濃度有關(guān)。一般而言，靈丹妙藥芝對于由亞適劑量Con A(0.625μg/ml)引起的淋巴細胞增殖起促進作用；但當細胞受適量Con A（2.5μg/ml）刺激而高度激活時，則起抑制作用，且作用與藥物濃度呈依賴關(guān)系。
對于由環(huán)磷酰胺引起免疫抑制的小鼠，靈芝可使被抑制的淋巴細胞增殖速度加快。但是靈芝在整體及試管內(nèi)對于由Lps誘導(dǎo)的淋巴細胞增殖并無刺激作用。這說明靈芝對B細胞的作用可能與對T細胞的作用機理不盡相同。
關(guān)鍵詞 靈芝；淋巴細胞增殖
靈芝（Ling Zhi, LZ, Ganoderma Lucidum, Fr. Karst）是一種真菌，具有廣泛的藥理作用，長期以來用作保健藥品。迄今有關(guān)其對免疫系統(tǒng)的作用研究不多，作用機理更不清楚。本文研究靈芝對小鼠淋巴細胞增殖的作用。
材 料 與 方 法
動物
昆明種小鼠，♂，18~22g，由上海醫(yī)科大學(xué)實驗動物部供應(yīng)。
試劑
靈芝熱水提取物呈棕黃色粉末，由日本和漢生藥研究所提供。取定量靈芝提取物，經(jīng)研磨溶于含0.2%羧甲基纖維素鈉的生理鹽水，置80℃水浴震蕩4h，此制劑作整體研究用。如用于試管內(nèi)研究，則取少量（約10mg）靈芝提取物，溶于生理鹽水，在80℃水浴振蕩2h，然后離心（1600rpm 10min），取上清液保存于4℃，臨用前再適當稀釋。此為靈芝的水溶性部分（Part A）。上述靈芝溶液在經(jīng)水浴振蕩后，置-30℃及37℃快速凍融3次，再離心取其上清液，即為靈芝提取物的凍融部分（Part B）。
RPMI-1640培養(yǎng)基，GIBCO產(chǎn)品，含Hepes 15mM,青霉素100 U/ml，鏈霉素100μg/ml，小牛血清10%，2-巰基乙醇5×10-5mmol。
刀豆蛋白A（Concanavalin A, Con A）,脂多糖（Lipopolysaccaride, Lps)均為Sigma產(chǎn)品。
3H-胸腺嘧啶核苷（3H-TdR）為中科院原子核研究所產(chǎn)品，比活性為1110 GBq/mmol。
試管內(nèi)淋巴細胞增殖試驗
小鼠以頸椎脫位致死，無菌取脾臟，分離脾細胞，尼龍網(wǎng)過濾，蒸餾水破壞紅細胞，調(diào)節(jié)至等滲，以RPMI-1640培養(yǎng)液洗三次，計數(shù)，調(diào)節(jié)細胞濃度為1×107/ml。于96孔培養(yǎng)板，每孔加入1×106個細胞、不同濃度的靈芝溶液單獨或聯(lián)合Con A和Lps。置37℃ 5%CO2
培養(yǎng)箱48h。培養(yǎng)終止前6h，每孔加入3H-TdR 9.25 KBq，用多頭細胞收集儀將細胞收獲至醋酸纖維薄膜，β-液閃儀測定3H-TdR的摻入值，以t試驗進行統(tǒng)計分析，每個條件復(fù)孔三個。
整體研究淋巴細胞增殖試驗
小鼠隨機分組，對照組口服0.2 CMC 0.5ml qd.×10;治療組口服靈芝300mg/kg,qd. ×10。按上述方法制備脾細胞，同上法培養(yǎng)后測定。
對免抑制小鼠的作用
小鼠40只，陰機分為4組。對照組口服靈0.2%CMC0.5ml/鼠，qd. ×10;環(huán)磷酰胺組腹腔注射10mg/kg qd.×5。靈芝兩組分別口服靈芝150、300mg/kg,qd.×10同時腹腔注射環(huán)磷酰胺10mg/kg qd.×5。按上法制備脾細胞及測定。
結(jié) 果
靈芝在試管內(nèi)對淋巴細胞增殖的影響
在無致裂原存在條件下，靈芝Part A 1～500μg/ml或Part B 1～10μg/ml單獨均可
刺激淋巴細胞攝取3H-TdR。但在更高濃度如Part A 1000μg/ml或Part B 100μg/ml以上則轉(zhuǎn)為抑制作用。由表1-1可以看出Part B的作用比Part A強，在較低濃度即開始轉(zhuǎn)向抑制。
表1-1 靈芝對試管內(nèi)淋巴細胞增殖的作用
藥物濃度 cpm/1×106細胞
（μg/ml） Part A Part B
0 2991±445 2991±445
1 3744±529 11208±554**
10 5997±699** 10532±1301**
100 8054±1013** 1595±18*
500 7668±1181** 1552±264*
1000 1126±156** 499±48**
Part A:水溶部分；PartB：凍融部分。X±SD；n=3；*P<0.05；**P<0.01
靈芝對于由Con A誘導(dǎo)的淋巴細胞增殖的影響與Con A的濃度密切相關(guān)，靈芝無論是Part A與Part B在1～500μg/ml均促進由低濃度Con A（0.625μg/ml）誘導(dǎo)的淋巴細胞增殖，作用與藥物濃度呈依賴關(guān)系。靈芝于更高濃度（>500μg/ml）時則轉(zhuǎn)向抑制效應(yīng)。
當淋巴細胞受適量Con A（1.25μg/ml）刺激時,靈芝作用介于上述兩者之間。其規(guī)律與低濃度Con A組相似，即低濃度靈芝呈刺激作用，而高濃度呈抑制作用（表1-2）。
表1-2 靈芝對Con A誘導(dǎo)的試管內(nèi)淋巴細胞增殖的作用
藥物濃度 cpm/1×106細胞
（μg/ml） Con A 0.65μg/ml Con A 1.25μg/ml Con A 2.5μg/ml
Part A 0 3589±44 19559±3087 69991±1894
1 5886±3020 35293±9642 58956±12175
10 13366±5995* 19954±8656 38487±2523*
100 19788±4285** 16944±6768 28640±10150**
500 9375±1677* 4948±2044** 15496±1254**
1000 984±117** 764±166** 4732±832**
Part B 1 16546±3217** 20509±4701 26034±7193**
10 15944±4801* 61059±5666** 35337±13165*
100 7407±585** 56432±7227** 17476±281**
500 4196±460** 4512±470** 16996±4123**
1000 685±28** 1918±98** 7347±825**
Part A:水溶部分；PartB：凍融部分。X±SD；n=3；*P<0.05；**P<0.01
靈芝在試管內(nèi)對于由5或10μg/ml Lps引起的淋巴細胞增殖主要呈現(xiàn)抑制作用。已知Lps為B細胞刺激劑，而Con A為T細胞刺激劑，由此可見靈芝對T與B細胞的作用不同（表1-3)。
表1-3 靈芝對Lps誘導(dǎo)的試管內(nèi)淋巴細胞增殖的作用
藥物濃度 cpm/1×106細胞
（μg/ml） Lps 5μg/ml Lps 10μg/ml
Part A 0 37420±2780 63123±6025
1 27369±665** 34113±820**
10 25348±1950** 33771±6324*
100 25901±2187** 30656±4311**
500 22080±675** 24727±3412**
1000 3942±733** 11528±2865**
Part B 1 30051±3862 37491±8736*
10 35341±5173 44201±1813**
100 34057±4299 30985±6037**
500 20221±3601** 26271±1357**
1000 7288±778** 8983±1413**
Part A:水溶部分；PartB：凍融部分。X±SD；n=3；*P<0.05；**P<0.01
二、靈芝對小鼠整體淋巴細胞增殖的影響
研究證明口服靈芝300mg/kg qd.×10的小鼠即使在無致裂原存在條件下淋巴細胞增生也比對照組為快.靈芝明顯刺激由Con A 0.625～1.25μg/ml誘導(dǎo)的淋巴細胞增殖。但在同一條件下對于由Lps 5或10μg/ml誘導(dǎo)的作用，靈芝卻呈現(xiàn)抑制效應(yīng)（表1-4）。
表1-4 靈芝對整體淋巴細胞增殖的影響
cpm/1×106 細胞
致裂原 μg/ml 0.2% CMC 300 mg/kg靈芝
-- -- 1338±94 2676±621**
Con A 0.625 4254±802 10168±1876**
1.25 21471±1563 42946±1001**
2.50 33685±1727 42031±9645
Lps 5 5427±996 420±186**
10 5963±30 339±4**
口服靈芝,qd.×10;X±SD; **P<0.01
三、靈芝對免疫抑制小鼠的作用
表1-5表明，環(huán)磷酰胺組在服藥后最初5天內(nèi)體重明顯低于對照組，以后又逐漸增加。但如聯(lián)合服用靈芝則在最初5天未見體重明顯下降。另外，環(huán)磷酰胺可使胸腺明顯縮小，重量減輕。靈芝使胸腺重量增加，300mg/kg劑量組與環(huán)磷酰胺組之前有明顯統(tǒng)計學(xué)差別（P<0.01）。
表1-5 靈芝和環(huán)磷酰胺對小鼠體重、胸腺和脾臟重量的影響
藥 物 劑量 體重（g） 胸腺 脾臟
（mg/kg） d0 d5 d10 （mg） （mg）
0.2% CMC -- 24.0±1.5 28.0±1.6 29.7±1.9 79.1±25.2 89.5±18.2
環(huán)磷酰胺 10 24.2±1.8 23.3±2.1*** 28.8±2.0 40.8±17.4*** 113.7±43.9
環(huán)磷酰胺 10 24.5±1.8 28.0±2.1 29.8±1.6 54.8±23.2* 113.2±19.0**
+靈芝 150
環(huán)磷酰胺 10 24.7±1.4 29.8±1.3* 30.7±1.0 66.3±18.4△△ 125.6±30.2***
+靈芝 300
各組的的脾細胞進行淋巴細胞增殖的研究，結(jié)果證明不論有無Con A或Lps存在，環(huán)磷酰胺（CYA）明顯抑制淋巴細胞增殖。但是靈芝聯(lián)合CYA組，淋巴細胞增殖明顯高于CYA組。與CYA單獨應(yīng)用組比較，150～300mg/kg靈芝顯著增加3H-TdR摻入（P<0.01）（表1-6）。
表1-6 靈芝與環(huán)磷酰胺聯(lián)合用藥對整體淋巴細胞增殖的影響
cpm/1×106細胞
致分裂劑 μg/ml 0.2% CMC CYA CYA+150mg/kg靈芝 CYA+300mg/kg靈芝
-- 4598±620 1992±342** 1527±190 1533±217
Con A 0.625 61403±10172 1475±159 7126±795 2684±58
1.25 83372±12369 1169±337 16231±5368 6655±2250*
2.5 84917±23495 3565±435 56274±12847 6559±1915
Lps 5 14003±3094 87±12** 4142±214** 763±43**
10 16845±2175 99±24** 3098±612** 460±27**
**
討 論
無論試管內(nèi)或整體研究均證明適量的靈芝可以直接刺激淋巴細胞增殖,高濃度則產(chǎn)生抑制。靈芝對T細胞的增殖作用決定于兩個主要的因素，一是細胞的狀態(tài)，另一是所用靈芝的濃度。靜止的T細胞，或為亞適劑量Con A輕度激活的細胞，靈芝可以增強Con A的作用而促進淋巴細胞增殖。但是如果T細胞受適量Con A刺激而高度激活時則靈芝抑制淋巴細胞增殖。Lps是一致裂原，主要刺激B細胞，對正常小鼠所整體研究以及試管內(nèi)研究均證明由Lps誘導(dǎo)的淋巴細胞增殖，靈芝主要呈現(xiàn)抑制效應(yīng)。已知環(huán)磷酰胺是一種免疫抑制劑，能抑制體液或細胞介導(dǎo)的免疫功能，抑制由Con A 或Lps誘導(dǎo)的淋巴細胞增殖。靈芝則能對抗環(huán)磷酰胺的免疫抑制作用而促進淋巴細胞增殖。
根據(jù)上述實驗研究結(jié)果，提示靈芝具有免疫調(diào)節(jié)作用，也許對于免疫功能受抑制的病人會有幫助，但應(yīng)考慮所用劑量。 |
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