| 靈芝護(hù)肝作用的實驗研究 |
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靈芝的熱水提取物250或500mg/kg口服可以明顯降低因D-氨基半乳糖和內(nèi)毒素合用導(dǎo)致中毒的小鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶的活力升高。靈芝在試管內(nèi)能減少大鼠原代培養(yǎng)肝細(xì)胞受四氨化碳中毒時釋放的乳酸脫氫酶及谷丙轉(zhuǎn)氨酶。靈芝也降低口服四氯化碳導(dǎo)致肝中毒的小鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶活力。由此證明靈芝對于受損的動物肝臟有一定的保護(hù)作用。
關(guān)鍵詞 靈芝；動物肝損傷；谷丙轉(zhuǎn)氨酶
靈芝是高等真菌Ganoderma Lucidum, Fr. Karst的子實體，在中國傳統(tǒng)用作補藥及鎮(zhèn)靜藥。根據(jù)《本草綱目》記載，靈芝能補五臟之氣。本文研究靈芝的熱水提取物對肝臟損傷動物病理模型的作用。
1967年發(fā)現(xiàn)D-氨基半乳糖可引起大鼠肝臟受損并稱其病理變化與人類肝炎病變有一定相似性。但動物對D-氨基半乳糖的敏感性存在較大的種屬與個體差異，小鼠遠(yuǎn)不及大鼠敏感。有報道內(nèi)毒素可以增加D-氨基半乳糖的毒性[1]。本實驗著重研究D-氨基半乳糖及內(nèi)毒素對小鼠肝臟的損害作用，并觀察靈芝對此損害的影響。此外，四氯化碳是一種經(jīng)典的肝毒劑，本研究分離大鼠肝細(xì)胞觀察四氯化碳對原代培養(yǎng)肝細(xì)胞的損害，并整體引致小鼠中毒，觀察靈芝對該中毒的影響。
材料與方法
動物
昆明種小鼠，21～26g;Sprague Danley(SD)種大鼠，180～220g�！帷饧嬗�。均由上海醫(yī)科大學(xué)實驗動物部供應(yīng)。
試劑
靈芝熱水提取物由日本和漢生藥研究所提供，為棕黃色粉末。取一定量靈芝提取物溶于0.2%羧甲基纖維素鈉（CMC），作整體動物研究。靈芝溶于生理鹽水中于80℃水浴振蕩2h后離心為水溶性部分（Part A）。在振蕩后經(jīng)三次快速凍融，然后離心，上清稱為凍融部分（Part B），作試管內(nèi)研究用。
D-氨基半乳糖（D-Galactosamine, Galn）由重慶醫(yī)科大學(xué)制備。內(nèi)毒素（Endotoxin,ET）O55B5由第二軍醫(yī)大學(xué)制備。I型膠原蛋白酶為Sigma產(chǎn)品。RPMI-1640培養(yǎng)基為GIBCO產(chǎn)品，含Hepes 15mM，青霉素100U/ml，鏈霉素100μg/ml及小牛血清10%。
D-氨基半乳糖與內(nèi)毒素所致小鼠中毒模型
小鼠隨機分為4組：第一組對照；第二組腹腔注射D-Galn 500mg/kg 30min 后再腹腔注射ET 100μg/鼠；第三組單獨腹腔注射ET；第四組單獨腹腔注射D-Galn。給毒劑后10h，分別取血，分離血清，測定血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT）及谷草轉(zhuǎn)氨酶（GOT）活力。
靈芝對聯(lián)合中毒小鼠肝臟的保護(hù)作用
小鼠隨機分成三組：第一組腹腔注射D-Galn 500mg/kg及ET100μg/鼠作對照；第二、三組分別口服靈芝250或500mg/kg qd.×2。最后一次服用靈芝后1h，腹腔注射D-Galn及ET。給毒劑后10h，小鼠摘眼球取血、分離血清，測GPT及GOT。
血清中IL-1活性測定
上述各組小鼠血清以BALB/c小鼠的胸腺細(xì)胞生物檢測其IL-1含量。選用BALB/c小鼠，分離胸腺，進(jìn)而分離胸腺細(xì)胞，尼龍網(wǎng)過濾，離心，洗2次，計數(shù)，調(diào)至1×107/ml含Con A 2.5μg/m。取96孔培養(yǎng)板，每孔加入胸腺細(xì)胞0.1ml及稀釋血清0.1ml，37℃ 5% CO2中培養(yǎng)72h。終止培養(yǎng)前6h，每孔加入3H-TdR 9.25kBq。培養(yǎng)結(jié)束后將細(xì)胞收集于纖維薄膜，β-液閃儀測cpm值。
大鼠離體肝細(xì)胞的制備及靈芝對CCl4中毒的保護(hù)作用
按Berry和Friend法分離大鼠肝細(xì)胞：大鼠于乙醚麻醉下門靜脈插管，恒壓灌流，流量9ml/min。開始時先灌流無Ca2+的生理溶液 A（96mM NaCl, 1.4mM KCl, 0.74mM MgSO4, 2.5mM KH2PO4,30mM NaHCO3及21.7mM葡萄糖酸鈉），持續(xù)通入95% O2/5% CO2的混合氣體，pH7.4, 恒溫37℃。洗凈肝臟內(nèi)血液后，灌B液，含0.02%膠原蛋白酶，持續(xù)灌流8min。然后灌C液，含Ca2+及牛血清白蛋白1%，持續(xù)灌流4min。分離肝臟，置燒杯中，溶液含Ca2+及牛血清白蛋白，剪破肝臟包膜，釋出肝細(xì)胞，于水浴中振蕩數(shù)分鐘，尼龍網(wǎng)過濾細(xì)胞，離心500rpm 1min。再洗2次。細(xì)胞于RPMI-1640溶液中計數(shù)，臺盼藍(lán)測活力應(yīng)達(dá)90～92%，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至5×106/ml。于24孔板中，每孔加入1ml。每組復(fù)管3孔。加入不同濃度靈芝（最終達(dá)0.01～10mg/ml）及20μl CCl4， 5% CO2 37℃培育1h，離心3000rpm,10min,分離上清，測定肝臟釋放的乳酸脫氫酶（LDH）及GPT，以加入1% Triton X-100后肝臟細(xì)胞釋放的酶活力為酶活力之總值[3]。
整體小鼠CCl4中毒及靈芝的保護(hù)
小鼠隨機分成4組：A組對照，B組腹腔注射0.01% CCl4 0.18ml/10g, C及D組分別口服靈芝250或500mg/kg qd.×2。在第二次服藥后1h腹腔注射上述量CCl4,24h后取血，分離血清，定量稀釋，測GPT和GOT。
結(jié) 果
一、D-Galn合并ET致小鼠肝臟中毒
D-Galn 500mg/kg單獨應(yīng)用，只使小鼠SGPT輕度上升。ET 100μg/鼠并不引起明顯的肝臟損害。當(dāng)D-Galn與ET合用時，SGPT明顯上升，P<0.01（表10-1）。
表10-1 D-氨基半乳糖和內(nèi)毒素致毒小鼠的血清酶活性
Galn ET 鼠數(shù) GPT GOT
組別 (mg/kg) (μg/只) （U/ml±SD） (U/ml±SD)
A -- -- 5 92±53 67±25
B 500 100 5 454±209** 106±16*
C 500 -- 5 157±88* 74±26*
D -- 100 4 59±17** 48±13*
B與A比較，C、D與B比較：*P<0.05, **P<0.01
二、靈芝對聯(lián)合中毒小鼠肝臟的保護(hù)作用
表10-2表明給予口服靈芝250及500mg/kg均明顯降低肝臟中毒小鼠的GPT活力，GOT亦有降低趨勢。
表10-2 靈芝對聯(lián)合致毒小鼠肝臟的保護(hù)作用
組 別 mg/kg Galn/ET 鼠數(shù) GPT GOT
（U/ml±SD） (U/ml±SD)
靈芝 -- + 6 1474±548 238±101
靈芝 250 + 6 583±733* 127±44*
靈芝 500 + 6 310±182** 162±161
Galn: 500mg/kg; ET: 100μg/鼠； *P<0.05, **P<0.01
取出上述各組小鼠的血清研究靈芝對中毒小鼠血清中IL-1樣物質(zhì)活力的影響。發(fā)現(xiàn)小鼠于聯(lián)合中毒后血清IL-1樣物質(zhì)水平明顯低于對照組。靈芝可使降低的IL-1趨于升高，提示聯(lián)合中毒小鼠免疫功能低下，靈芝對具有免疫調(diào)節(jié)作用的單核細(xì)胞因子的IL-1有一定的調(diào)節(jié)作用（表10-3）。
表10-3 靈芝對聯(lián)合中毒小鼠IL-1樣物質(zhì)的影響
血清稀釋
鼠數(shù) 1∶40 1∶20 1∶10
對照 5 16319±6261 5828±1241 627±158
Galn/ET 4 7240±4843 2876±2439 480±393
靈芝Galn/ET 5 11351±7384 3085±1746 308±88
三、靈芝對CCl4致離體大鼠肝細(xì)胞中毒的保護(hù)作用
表10-4結(jié)果表明，靈芝對CCl4中毒的原代培養(yǎng)肝細(xì)胞有一定保護(hù)作用。加入靈芝以后，肝細(xì)胞釋放的LDH及GPT均明顯降低。
表10-4 靈芝對CCl4中毒毒肝細(xì)胞的作用
CCl4 靈芝 LDH GPT
μl/孔 mg/ml X±SD 釋放率（%） X±SD 釋放率（%）
-- -- 6800±200 39.4 43±3 23.6
CCl4 20 -- 14483±525 84.0 145±5 79.7
Part A 20 0.01 10225±225 59.3 85±6 46.7
20 0.1 9667±289 56.0 86±6 47.5
20 1 9417±144 54.6 85±2 46.9
20 10 9983±475 57.9 51±5 28.0
Part B 20 0.01 7717±375 44.7 62±3 34.1
20 0.1 9667±289 56.0 88±4 48.1
20 1 8700±260 50.4 73±6 40.3
20 10 10900±450 63.2 48±3 26.4
四、靈芝對整體CCl4中毒小鼠的作用
表10-5結(jié)果表明靈芝能明顯降低CCl4中毒小鼠的血清GPT活力。
表10-5 靈芝對CCl4致毒肝臟的保護(hù)作用
組別 mg/kg CCl4 n GPT GOT
(ml/10g) (U/ml±SD) (U/ml±SD)
對照 -- -- 9 52±7 164±96
CCl4 -- 0.18 9 1015±0 426±756
靈芝 250 0.18 10 883±235 2192±1366
靈芝 500 0.18 10 712±396 1660±930
討 論
早在1000多年前，中國古代醫(yī)藥學(xué)者已經(jīng)注意到靈芝對肝臟的作用，故有靈芝“補肝氣”之說。當(dāng)然在《本草》中所指的“肝臟”具有更廣泛的含義，其所指靈芝具有補肝氣作用的確切含義亦待研究。
本研究重點是靈芝對肝臟受損病理模型的影響。
GPT和GOT均為反映肝細(xì)胞變性壞死的酶類，當(dāng)肝細(xì)胞因中毒等發(fā)生變性壞死時酶類會釋放出來，使血清中該類酶水平升高。由于GOT尚分布于心臟、腎臟與骨骼肌，而GPT則主要分布于肝臟，故血清GPT水平反映肝臟受損較GOT更特異，更敏感，在臨床急性肝炎時持續(xù)升高時間也最長。靈芝能明顯降低兩種整體病理模型及中毒離體肝細(xì)胞釋放的GPT，表明靈芝有一定的護(hù)肝作用。
乳酸脫氫酶廣泛分布于體內(nèi)各組織，催化乳酸轉(zhuǎn)變?yōu)楸�。肝炎的發(fā)病早期血清中該酶升高，亦反映肝細(xì)胞的受損。本文原代培養(yǎng)的大鼠肝細(xì)胞在CCl4中毒時LDH釋放顯著升高，靈芝能使之降低，亦提示靈芝的護(hù)肝作用。
IL-1是一種重要的單核細(xì)胞因子，有廣泛的生物學(xué)活性，參與主要的免疫反應(yīng)過程，其重要作用之一是刺激T細(xì)胞產(chǎn)生IL-2，既能調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的水平，又有效應(yīng)作用。在肝臟中毒時有關(guān)血清IL-1的水平未見報道，本研究用D-Galn和內(nèi)毒素造成肝臟中毒，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這種聯(lián)合中毒致肝損傷的小鼠，血清中IL-1水平較正常動物的水平為低，提示肝臟中毒時機體的免疫功能下降。服用靈芝后IL-1水平有上升趨勢，這與本室其他研究結(jié)果相符，說明靈芝具有一定的免疫調(diào)節(jié)作用。 |
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