| 靈芝的化學(xué)成分 |
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靈芝類(lèi)所含化學(xué)成分復(fù)雜，且因所用菌種培養(yǎng)方法、提取方法等不同而異。研究靈芝類(lèi)的化學(xué)成分的目的，在于了解和比較靈芝屬不同品種及同一品種的不同發(fā)育階段(如子實(shí)體、菌絲體、孢子體)所含的化學(xué)成分，通過(guò)藥理及臨床研究確定其有效成分或有效部分。為進(jìn)一步研究靈芝藥理作用機(jī)制、提高臨床療效、改進(jìn)生產(chǎn)工藝及質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提供理論根據(jù)。目前研究較多的靈芝化學(xué)成分有：三萜類(lèi)化合物、多糖類(lèi)、核苷類(lèi)、甾醇類(lèi)、生物堿類(lèi)、呋喃衍生物、氨基酸多肽類(lèi)、無(wú)機(jī)元素、脂肪酸等。
第一節(jié) 三萜類(lèi)化合物
三萜類(lèi)化合物是靈芝的主要化學(xué)成分之一，靈芝中的很多三萜類(lèi)化合物具有生理活性，如ganoderic acid A. B. C.和D能夠抑制小鼠肌肉細(xì)胞組胺的釋放。ganoderic acid F有很強(qiáng)的抑制血管緊張素酶的活性。赤芝孢子酸A對(duì)CCl4和半乳糖胺及丙酸桿菌造成的小鼠轉(zhuǎn)氮酶升高均有降低作用。赤芝孢子內(nèi)酯A具有降低膽固醇作用。因此對(duì)三萜類(lèi)化合物的進(jìn)一步深入研究將有利于靈芝有效成分的尋找和進(jìn)一步闡明其生理活性。
1982年Kubota. T等人首次從赤芝子實(shí)體中分離得到三萜類(lèi)化合物，此后十年來(lái)，對(duì)三萜類(lèi)化合物研究最多的是日本，其次是中國(guó)(包括臺(tái)灣)。到目前為止已先后從赤芝子實(shí)體和孢子粉中分到了103種新的三萜類(lèi)化學(xué)成分
一、三萜類(lèi)化合物提取和分離
靈芝中三萜類(lèi)化合物的提取分離方法可以分為三類(lèi)，一類(lèi)是用甲醇或者乙醇提取原料，提取物直接進(jìn)行層析分離，如H. Konda等用甲醇提取原料，提取物濃縮后懸浮于水，依次用已烷、乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯部分經(jīng)硅膠色譜、高效液相層析(HPLC)分到四個(gè)三萜酸。第二類(lèi)方法是用甲醇、乙醇等提取原料，然后分出總酸部分，進(jìn)行分離，如Morigiwa等人用70%甲醇提取原料，提取物用1mol/L HCl調(diào)pH2~3，再用乙酸乙酯萃取，濃縮后進(jìn)行分離，分到五個(gè)三萜類(lèi)化合物。Nishitoba等人用乙醇提取原料，提取物濃縮后在水和CHCl3中進(jìn)行分配，CHCl3層濃縮至一定體積后，用飽和的NaHCO3水溶液萃取，萃取物用6mol/L HCl酸化到pH3~4，水溶液中出現(xiàn)的沉淀以CHCl3溶解，干燥后得總酸提取物，經(jīng)硅膠柱層析分到五個(gè)三萜類(lèi)化合物。第三類(lèi)方法是利用制備衍生物的方法進(jìn)行分離，如KiKuchi等用乙醚提取原料，其酸性部分用重氮甲烷進(jìn)行甲基化，然后再在硅膠柱上進(jìn)行分離，從中分到七個(gè)三萜酸。Hirotani等用90%MeOH-H2O提取，提取液減壓濃縮后加入5%Na2CO3水溶液堿化至pH9，然后用CHCl3萃取，水層用4mol/L H2SO4酸化至pH2，再用CHCl3萃取，CHCl3萃取液用水洗，Na2SO4干燥，濃縮后得總酸部分，該部分再以常規(guī)方法用重氮甲烷進(jìn)行甲酯化，硅膠柱色譜，得到三個(gè)新的三萜酸。
靈芝中三萜化合物的分離大多是經(jīng)過(guò)反復(fù)硅膠柱層析，較純的部分薄層、低壓柱，高效液相色譜(正反相)制備等方法進(jìn)行分離純化。硅膠柱色譜一般常用的展開(kāi)劑為MeOH-CHCl3，EtAc-C6H6，EtoAc-acetone，EtOAc-CHCl3，CHCl3-MeOH-H2O等系統(tǒng)。HPLC多用乙腈—乙酸銨緩沖溶液以及MeOH-H2O洗脫。薄層檢查一般使用的展開(kāi)劑為CHCl3-MeOH(95∶5，9∶1V/V)或苯—乙酸乙酯(3∶7V/V)，香蘭醛-硫酸做為薄層斑點(diǎn)的顯色劑。
我們?cè)鴱某嘀ユ咦臃鬯嵝灾懿糠种蟹值狡邆�(gè)三萜類(lèi)化合物，其中五個(gè)四環(huán)三萜酸，一個(gè)四環(huán)三萜醇，二個(gè)五環(huán)三萜內(nèi)酯化合物，并對(duì)它們的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了測(cè)定證明有三個(gè)新化合物，其余均為首次從赤芝孢子粉中分離出來(lái)。下面是三萜類(lèi)化合物提取分離流程。
二、三萜類(lèi)化合物的結(jié)構(gòu)測(cè)定
(一)三萜類(lèi)化合物的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)
靈芝三萜類(lèi)化合物分為四環(huán)三萜和五環(huán)三萜。從靈芝四環(huán)三萜類(lèi)化合物的結(jié)構(gòu)來(lái)看，屬于高度氧化的羊毛甾烷衍生物。按分子所含碳原子數(shù)可分為C30，C27和C24三大類(lèi)，根據(jù)其所含功能團(tuán)和不同的側(cè)鏈可有以下六種基本骨架。
在三萜酸的結(jié)構(gòu)中，環(huán)上的雙鍵大多位于△8(9)位，在C11位和C23位大部分有羰基，而且在C3、C7、C15位也多被羥基或羰基所取代。在三萜醇、醛和過(guò)氧化物的結(jié)構(gòu)中環(huán)上大多存在兩個(gè)不飽和雙鍵，其位置在△7(8)，△9(11)位，C11位和C23位也不存在羰基而且環(huán)上的取代基明顯減少。表6-1列出了迄今為止分到的所有靈芝三萜化合物。目前靈芝三萜化合物的命名有些混亂，同一化合物有不同的名稱(chēng)，對(duì)此我們采用最早的命名。
(二)三萜類(lèi)化合物的光譜特征
1.紅外光譜:靈芝中的三萜類(lèi)化合物大多都有羥基,因而在3300cm-1，1050cm-1有強(qiáng)的羥基吸收峰。三萜酸類(lèi)化合物在2600～2400cm-1有弱吸收峰，當(dāng)羧酸被酯化以后這一吸收峰消失。在C15位有羰基的化合物在1740～1760cm-1會(huì)出現(xiàn)五元環(huán)酮的吸收特征峰。在1720cm-1(酯)，1710cm-1(六元環(huán)酮)，1650cm-1(α、β不飽和酮)也有較強(qiáng)的吸收峰。
2.紫外光譜：由于靈芝中的三萜類(lèi)化合物大多都有共軛體系存在，因而紫外吸收波長(zhǎng)和強(qiáng)度也很有規(guī)律，凡在C11位存在羰基的化合物都存在著△8(9)雙鍵，這類(lèi)化合物的紫外吸收大多在λmax253nm，logε在3.8～4.1之間，而C11位沒(méi)有羰基的化合物，大多存在著△7(8)、△9(11)共軛雙鍵，因而紫外吸收在λmax237nm，244nm，253nm有三個(gè)吸收峰，而吸收強(qiáng)度大多在logε3.7～4.1之間。而在既沒(méi)有α、β不飽和酮，又沒(méi)有共軛雙鍵的化合物中，紫外光譜僅表現(xiàn)簡(jiǎn)單的雙鍵末端吸收在λmax210nm logε4.2左右。
3.質(zhì)譜：四環(huán)三萜化合物質(zhì)譜裂解的共同特征是失去側(cè)鍵。羊毛甾烷類(lèi)的特征裂解是從D環(huán)斷裂，伴有一個(gè)質(zhì)子的轉(zhuǎn)移，然后經(jīng)第二次裂解失去側(cè)鏈和D環(huán)的一部分。Kikuchi[11] 在這方面作了很多研究，總結(jié)出這類(lèi)化合物的裂解方式大致如下：
4.核磁共振譜：三萜類(lèi)化合物的1HNMR中主要信號(hào)是雙鍵質(zhì)子，連氧碳質(zhì)子和甲基質(zhì)子(見(jiàn)表6-2)。環(huán)內(nèi)雙鍵質(zhì)子的δ值一般大于5×10-6，在靈芝三萜化合物中，如ganoderic acid R. S. T. X. Y. Me等的雙鍵位置在△7(8)和△9(11)，7位質(zhì)子的δ值在(5.48～5.86)×10-6之間,11位質(zhì)子的δ值比7位要處于高場(chǎng),在δ(5.31～5.39)×10-6之間，側(cè)鏈上雙鍵的位置可分為二類(lèi)，一類(lèi)在△20(22)，20位質(zhì)子的信號(hào)在δ(6.04～6.12)×10-6，如ganoderenic acid A.B.C.D等。另一類(lèi)在△24(25)，24位質(zhì)子的信號(hào)在δ(5.4～5.7)×10-6，如ganoderol A和B。
連氧碳質(zhì)子由于位置、環(huán)境和構(gòu)型的不同，其化學(xué)位移變化較大。在C3、C7、C12、C15為羥基取代的化合物中由于羥基構(gòu)型不同，該碳所連接H的化學(xué)位移值和偶合常數(shù)也不同，3—H多為α構(gòu)型，δ值在(3.22～3.31)×10-6，J=10Hz，7—H為α構(gòu)型時(shí)δ：(4.75～4.85)×10-6，J=9Hz，7—H為β構(gòu)型時(shí)，δ：(4.4～4.5)×10-6，J=5Hz。12—H多為α構(gòu)型，δ：(4.5～4.9)×10-6。15—H多為β構(gòu)型，δ(4.2～4.90)×10-6。三萜中的甲基信號(hào)上有較多的取代基，對(duì)甲基的化學(xué)位移影響較大。18—CH3通常在δ(0.95～1.0)×10-6之間，當(dāng)分子中存在△7(8)、△9(11)共軛雙鍵時(shí)，該甲基信號(hào)向高場(chǎng)位移至δ(0.55～0.60)×10-6，當(dāng)12位有羥基取代時(shí)，該信號(hào)出現(xiàn)在δ0.85×10-6左右。21—CH3信號(hào)通常出現(xiàn)在δ(0.85～1.0)×10-6之間，為雙峰，但當(dāng)20位有羥基取代時(shí)，該信號(hào)向低場(chǎng)位移，出現(xiàn)在δ(1.4～1.6)×10-6，當(dāng)存在△20(22)雙鍵時(shí)，該信號(hào)出現(xiàn)在δ2.1×10-6，且都為單峰。27—CH3通常出現(xiàn)在δ(1.1～1.2)×10-6，當(dāng)存在△24(25)雙鍵時(shí)，該甲基信號(hào)在δ1.6×10-6左右。32—CH3受7位和15位取代基的影響較大。當(dāng)7位和15位同時(shí)被羰基取代時(shí)，該號(hào)在δ(1.6～1.8)×10-6之間，當(dāng)7位和15位均為羥基或一個(gè)羥基一個(gè)羰基時(shí)則無(wú)明顯變化均出現(xiàn)在δ(1.2～1.3)×10-6之間，當(dāng)7位和15位無(wú)取代基時(shí)，該甲基信號(hào)則出現(xiàn)在δ0.88×10-6左右。30—CH3和31—CH3受3位取代基影響較大，當(dāng)3位是羥基時(shí)30—CH3在δ1.0×10-6左右，31—CH3在δ0.85×10-6左右。當(dāng)3位是羰基時(shí)，17—H在δ1.8×10-6左右，而當(dāng)15位是羰基時(shí)17—H向低場(chǎng)移至δ2.2×10-6左右。從17—H的位置可以判斷C15位所連接的基團(tuán)。
13CNMR的運(yùn)用使得化合物基本骨架的確定日趨準(zhǔn)確。三萜化合物的碳譜中最容易分辨的信號(hào)來(lái)自雙鍵碳原子和連氧碳原子。前面提過(guò)靈芝三萜母核上的雙鍵位置有兩類(lèi)，在△8(9)這類(lèi)化合物中，C8在δ(151～160)×10-6，C9在δ(140～146)×10-6，在△7(8)和△9(11)這類(lèi)化合物中C7在δ(120～121)×10-6，C8在δ(140～142)×10-6，C9在δ(141～145)×10-6，C11在δ(115～117)×10-6。側(cè)鏈上的雙鍵位置也有兩類(lèi)，一類(lèi)是△20(22)，C20在δ(154～157)×10-6，C22在δ(124.3～124.7)×10-6；另一類(lèi)是△24(25)，C24在δ(139～145)×10-6，C25在δ(126～129)×10-6。當(dāng)下列各碳連有羥基時(shí)，它們的化學(xué)位移值分別為C3δ(77～79)×10-6，C7δ(66～68)×10-6，C12δ(77～79)×10-6，C15δ(72～74)×10-6。當(dāng)下列各碳連有羰基時(shí)，它們的化學(xué)位移值分別為C3δ(215～216)×10-6，C7δ(198～200)×10-6，C15δ(205～217)×10-6，C23δ(207～208)×10-6。羧酸酯的化學(xué)位移在δ(170～178)×10-6。C3、C7、C15取代基不同時(shí)，C1在δ(35～37)×10-6，C2在δ(34.1～34.8)×10-6，C4在δ(46～47)×10-6，當(dāng)C3連接的是羥基時(shí)，這三個(gè)碳的信號(hào)均向高場(chǎng)位移，C1在δ34×10-6，C2δ27×10-6，C4δ38×10-6左右。C7是羰基取代時(shí)C6在δ(33～37)×10-6，C7是羥基取代時(shí)C6在δ(26～28)×10-6。C15是羰基時(shí)C14在δ(57～59)×10-6，C15是羥基時(shí)，C14在δ(52～53)×10-6。
近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的1H—1H和1H—13C COSY等二維核磁共振譜已應(yīng)用在靈芝三萜結(jié)構(gòu)的測(cè)定中。
5.旋光光譜：旋光光譜主要是解決絕對(duì)構(gòu)型問(wèn)題，從文獻(xiàn)報(bào)道的CD譜數(shù)據(jù)總結(jié)出CD譜與絕對(duì)構(gòu)型關(guān)系；凡是具有[I]式絕對(duì)構(gòu)型者，C7為羥基，不管3位或15位是羥基或羰基取代，CD譜都呈現(xiàn)下列Cotton效應(yīng)，(290～295)nm(—)，(248～257)nm(+)，(207～217)nm(—)；凡是在[I]式結(jié)構(gòu)中C7為酮基者，則不管3位或15位的取代基如何，都呈現(xiàn)如下Cotton效應(yīng)：(305～307)nm(—)，(272～278)nm(+)，(253～256)nm(—)，(225～231)nm(+)。
Nishitoba等人在鑒定epoxyganoderiol A的絕對(duì)構(gòu)型時(shí)，應(yīng)用CD譜確定了C24和C25的絕對(duì)構(gòu)型。在epoxyganoderiol A的側(cè)鏈上存在著一個(gè)環(huán)氧基團(tuán)，為了確定24和25位是S還是R，首先以羊毛甾醇為原料，經(jīng)反應(yīng)得到S和R兩種構(gòu)型的化合物，反應(yīng)如下：
a)AC2O/pyridine, b) SeO2/dioxane, c) NaBH4/CeCl3·7H2O/MeOH-THF
d)(+)-DETor (-) -DET/Ti (O1Pr) 4/TBHP/CH2Cl2
分別將7b和7a溶于CCl4溶液中，加入Eu(fod)3絡(luò)合物，測(cè)其旋光譜，得到如下結(jié)果：
以上兩個(gè)化合物的CD譜的Cotton效應(yīng)是與C25的Newman投影相一致的。正Cotton效應(yīng)為25S負(fù)Cotton效應(yīng)為25R。在相同條件下測(cè)epoxyganoderiol A的CD譜，顯示313nm(△ε+10.9)為正Cotton效應(yīng)，證明25位的絕對(duì)構(gòu)型為S，通過(guò)測(cè)定NOE，證實(shí)24位絕對(duì)構(gòu)型為S。
(三)結(jié)構(gòu)測(cè)定中的化學(xué)反應(yīng)
隨著儀器分析新技術(shù)、新方法的發(fā)展，各類(lèi)譜學(xué)方法和X射線(xiàn)—衍射等分析手段已在結(jié)構(gòu)測(cè)定中得到了廣泛的應(yīng)用。經(jīng)典的化學(xué)方法與儀器分析相結(jié)合，使三萜化合物的結(jié)構(gòu)測(cè)定快速而準(zhǔn)確并達(dá)到了微量的水平�；瘜W(xué)反應(yīng)常用于證實(shí)分子骨架中取代基類(lèi)型、數(shù)目、位置及構(gòu)型等。
1.氧化反應(yīng) 氧化反應(yīng)主要用來(lái)確定分子中所含羥基、羰基或�；臄�(shù)目和位置等。應(yīng)用較多的是將羥基氧化成羰基，比較常用的是鉻酐—吡啶的方法，也有將鉻酐溶于AcOH中攪拌加入樣品中，室溫下攪拌2h，用水稀釋?zhuān)确绿崛。崛∫航?jīng)水洗干燥濃縮后經(jīng)薄層制備而得到氧化產(chǎn)物。
2.�；磻�(yīng) �；磻�(yīng)對(duì)于確定分子中羥基的數(shù)目、性質(zhì)、構(gòu)型很有幫助，常用的乙�；磻�(yīng)，通常采用醋酐—吡啶室溫處理的方法。
3.水解 由于部分靈芝三萜酸中帶有乙�；�，為確定乙酰基的存在和數(shù)目，采用了水解的方法，如Komoda將ganoderic acid F溶于甲醇，用5%Na2CO3室溫處理3h后，用2mol/L HCl酸化，除去甲醇后用CHCl3萃取，水洗CHCl3液后Na2SO4干燥，蒸干。通過(guò)TLC制備得水解產(chǎn)物。
4.還原 還原反應(yīng)主要用來(lái)確定分子中有無(wú)不飽和雙鍵及羥基、羰基、取代基的位置。如Nishitoba等人在確定lucidenato G結(jié)構(gòu)時(shí)，為了證實(shí)C26位上存在著羥基，先將lucidenate G甲基化，然后再用NaBH4進(jìn)行還原，得到其丙酮化物，從而證實(shí)了C26位存在著一個(gè)羥基。
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